Fluorescencinis mikroskopas: veikimo principas, konstrukcija ir panaudojimas

Fluorescencinis mikroskopas: supraskite veikimo principą, konstrukciją ir praktinį panaudojimą gyvybės moksluose bei diagnostikoje — aiškiai ir suprantamai.

Fluorescencinis mikroskopas - tai optinis mikroskopas, kuriame organinėms ir neorganinėms medžiagoms tirti naudojama fluorescencija ir fosforescencija. "Fluorescencinis mikroskopas" - tai bet koks mikroskopas, kuriame vaizdui gauti naudojama fluorescencija. Tai taikoma tiek paprastesnei sąrankai, tiek sudėtingesnei konstrukcijai.

Dauguma fluorescencinių mikroskopų, ypač naudojamų gyvybės moksluose, yra epifluorescencinės konstrukcijos, parodytos schemoje. Sužadinimo bangos ilgio šviesa apšviečia bandinį per objektyvą. Pavyzdžio skleidžiama fluorescencija sufokusuojama į detektorių. Dichroinis pluošto skirstytuvas veikia kaip tam tikro bangos ilgio filtras, praleidžiantis fluorescuojančią šviesą į okuliarą arba detektorių, bet atspindintis likusią sužadinimo šviesą atgal į šaltinį.

Veikimo principas

Fluorescencinio mikroskopo pagrindas – dviejų skirtingų bangų ilgių sąveika: sužadinimo (excitation) ir emisijos (emission). Sužadinimo šaltinis (paprastai monochromatinė arba plataus spektro lemputė, LED arba lazeris) tiekia energiją fluoroforams mėginyje. Fluoroforai absorbuoja sužadinimo fotonus ir greitai (pikosekundėse–nanosekundėse) skleidžia fotonus ilgesnio bangos ilgio pavidalu (emisija). Emisija atskiriama nuo sužadinimo su žiediniais arba dichroiniais filtrais ir nukreipiama į detektorių ar okuliarą.

Pagrindinės konstrukcijos dalys

• Šviesos šaltinis: žarnelė (Hg, metalinė halogeninė), LED, arba lazeris (konkrečiai confocal ar TIRF sistemoms).
• Filtrų rinkinys: sužadinimo filtras, dichroinis filtras ir emisijos filtras – užtikrina, kad detektorius gautų tik fluorescencinę signalą.
• Objektyvas: didelis numerinis apertūros (NA) – svarbu šviesos surinkimui ir erdviniam bei spektriniam skiriamumui; dažnai naudojami imersiniai objektai (aliejus, vanduo).
• Paviršiaus/konfokalinis elementas: konfokaliniame mikroskope – diafragma (pinhole) atmetanti nesufokusuotą šviesą.
• Detektoriai: CCD, sCMOS kameros plačiajuostėms sistemoms; fotomultiplikatoriai (PMT) arba hibridiniai detektoriai konfokalinėms ir multi-photon sistemoms.
• Mechanika ir programinė įranga: tikslūs stadijų judesiai, automatizuotas fokusavimas, daugiaspalvių kanalų valdymas ir vaizdų apdorojimas.

Tipai ir atitinkamos savybės

• Plačiajuostės (widefield) fluorescencinės sistemos: paprastesnės, greitos, tinkamos ryškio kontrasto vaizdams ir daugelio ląstelių eksperimentams, bet sufferuoja nuo nesufokusuoto fono.
• Konfokaliniai mikroskopai: naudoja taškinį skenavimą ir pinhole, kad pašalintų iš fokusavimo sklindančią šviesą – suteikia aštresnius optinius pjūvius ir leidžia rekonstruoti 3D vaizdus.
• Multiphoton (dvifotonis) mikroskopas: naudoja infraraudonųjų impulsinių lazerių sužadinimą, leidžia gilintis į audinius iki kelių šimtų mikrometrų, mažesnė fotožala paviršiui.
• TIRF (total internal reflection fluorescence): sukuria evanescentinę bangą, kuri sužadina fluoroforus tik ~100–200 nm nuo dangtelio – idealu membranų ir paviršiaus procesų tyrimams.
• Superrezoliucijos metodai (STED, PALM, STORM ir kt.): leidžia viršyti difrakcijos ribą ir pasiekti nanometro dydžio detales.

Žymėjimas ir mėginių paruošimas

Fluorescencijai tirti reikalingas specifinis žymėjimas:

• Fluorescenciniai dažai: FITC, TRITC, Alexa serija – plačiai naudojami eksperimentams su fiksuotomis preparatomis.
• Fluorescenciniai baltymai: GFP, mCherry ir jų variantai – leidžia gyvai sekti genų ekspresiją ir ląstelės procesus.
• Quantum dots: puslaidininkinės nanodalelės, pasižyminčios siauru emisijos spektru ir dideliu stabilumu prieš blukimą.
• Imunofluorescencija: tiesioginis arba netiesioginis antikūnų žymėjimas, reikalaujantis fiksavimo, permeabilizacijos ir blokavimo žingsnių.
• Mėginių montavimas: tinkama montavimo terpė (antifade reagentai), dangtelio stiklas ir hermetiškas sandarinimas gyvų ląstelių tyrimams.

Panaudojimas

• Celijų biologija: baltymų lokalizacija, ląstelių signalizacija, organelių dinamika.
• Histologija ir patologija: eigos žymėjimas audiniuose, vėžio markerių identifikavimas.
• Neurobiologija: sinapsių, nervinių grandinių žymėjimas ir gyvo audinio vaizdavimas.
• Medžiagų mokslas: fluorescencinės medžiagos, polimerai, nanodalelių charakterizacija.
• Forenzika ir diagnostika: specifinių molekulių aptikimas ir kvantifikavimas.

Privalumai ir trūkumai

• Privalumai: didelis jautrumas, galimybė žymėti kelis taikinius vienu metu (multicolor), gyvų procesų stebėjimas, 3D rekonstrukcijos galimybė (konfokalas).
• Trūkumai: fotoblekavimas (photobleaching), fototoksinumas gyvoms ląstelėms, autofluorescencija iš foninių komponentų, ribota erdvinė rezoliucija (išskyrus superrezoliucines technikas).

Praktiniai patarimai

• Rinkitės tinkamą fluoroforų kombinaciją, kad būtų mažas spektrinis persidengimas ir tarpusavio kvenchingas.
• Naudokite antifade montavimo terpę ir mažinkite sužadinimo intensyvumą bei ekspozicijos laiką, kad sumažintumėte fotoblekavimą.
• Kalibruokite ir reguliariai prižiūrėkite optiką (filtrus, dichroinius veidrodžius, objektyvus) ir detektorius, kad išvengtumėte artefaktų.
• Jeigu reikia gilios audinio vaizdų – apsvarstykite multiphoton metodą; jei reikalinga paviršiaus detalių analizė – TIRF.

Išvados

Fluorescencinis mikroskopas yra universalus įrankis mokslui ir pramonei, leidžiantis jautriai ir selektyviai vizualizuoti molekulinius ir ląstelinius procesus. Tinkamai parinkus žymėjimus, optiką ir vaizdų apdorojimo metodus, galima gauti informatyvius 2D ir 3D vaizdus bei sekti procesus gyvai su minimaliu poveikiu mėginiui.

Klausimai ir atsakymai

K: Kas yra fluorescencinis mikroskopas?

K: Ką reiškia terminas "fluorescencinis mikroskopas"?

K: Kokios konstrukcijos yra dauguma gyvybės moksluose naudojamų fluorescencinių mikroskopų?

K: Kaip fluorescencinis mikroskopas apšviečia pavyzdį?

K: Kaip fluorescenciniame mikroskope aptinkama pavyzdžio skleidžiama fluorescencija?

K: Kokią funkciją fluorescenciniame mikroskope atlieka dichroinis spindulių skirstytuvas?

K: Kuo skiriasi fluorescencija nuo fosforescencijos?

Paieška pagal raidę