Molekulinis klonavimas – apibrėžimas, metodai, vektoriai ir taikymai

Sužinokite, kas yra molekulinis klonavimas: apibrėžimas, pagrindiniai metodai, vektoriai ir praktiniai taikymai biomedicinoje bei biotechnologijoje.

Molekulinis klonavimas yra molekulinės biologijos darbo rūšis, kurios tikslas – sukurti ir plėtoti rekombinantines DNR molekules bei jas replikacijai nukreipti į gyvus organizmus‑šeimininkus. Žodžio klonavimas vartojimas reiškia, kad DNR molekulė iš vienos ląstelės naudojama dideliam, genetiškai identiškų molekulių turinčiam ląstelių skaičiui sukurti. Molekulinio klonavimo metodai yra kertiniai daugelyje šiuolaikinės biologijos ir medicinos sričių.

Kas vyksta molekuliniame klonavime?

Molekuliniam klonavimui paprastai naudojamos dviejų skirtingų organizmų DNR sekos: rūšies, kuri yra klonuojamos DNR šaltinis, ir rūšies, kuri bus gyvasis šeimininkas rekombinantinei DNR daugintis (replikuotis). Atliekant eksperimentą, klonuojama DNR gaunama iš donorinio organizmo, po to mėgintuvėlyje apdorojama fermentais arba amplifikuojama polimerazės grandinine reakcija (PCR), kad būtų gauti tinkamo dydžio fragmentai.

Šie fragmentai sujungiami su vektoriaus DNR (plazmidu, virusu ar kitu vektoriumi) ir taip gaunamos rekombinantinės DNR molekulės. Tada rekombinantinė DNR įvedama į organizmą‑šeimininką (dažnai lengvai auginamą ir saugią laboratorinę E. coli atmainą). Rezultatas – populiacija ląstelių, kuriose rekombinantinė DNR replikuojasi kartu su šeimininko genomu. Kadangi jose yra svetimos DNR sekos, tokie organizmai dažnai vadinami transgeniniais arba genetiškai modifikuotais mikroorganizmais (GMO).

Molekulinio klonavimo eiga — pagrindiniai žingsniai

• Genetinės medžiagos parinkimas ir izoliacija: pasirinktas genas arba DNR fragmentas izoliuojamas iš donorinio šaltinio arba amplifikuojamas PCR.
• Fragmentų paruošimas: DNR fragmentai apdorojami restrikciniais endonukleazėmis arba kitomis metodikomis (pvz., PCR su pridėtais jungtimų regionais), kad būtų suderinami su vektoriumi.
• Inzercija į vektorių: fragmentai liguojami į vektoriaus DNR arba surenkami naudojant modernesnius jungimo metodus (žr. metodus žemiau).
• Transformacija arba transdukcija: rekombinantinis vektorius įvedamas į pasirinktinį šeimininką (elektroporacija, cheminė transformacija, virusinė transdukcija).
• Pasirinkimas ir atranka: naudojami selekcijos žymenys (antibiotikų atsparumas, metaboliniai žymenys), kad būtų identifikuotos ląstelės, turinčios vektorių.
• Patikra: teisingumo patikra atliekama naudojant PCR, restrikcijų žemėlapius, lentelinius tyrimus ar DNR sekvenavimą.

Dažniausi metodai

• Restrikcinių fermentų ir ligazės metodas: tradicinis požiūris, kai DNR ir vektorius pjaustomi tais pačiais fermentais ir sujungiami DNR ligaze.
• TA/TOPO klonavimas: naudojamas PCR produktams, turintiems 3' A perteklių; paprastas ir greitas be restrikcinių fermentų.
• Gibson Assembly: vieno mėgintuvėlio metodas, leidžiantis sujungti kelis fragmentus nustatytomis overlappinėmis sekomis be restrikcinių vietų.
• Golden Gate klonavimas: remiasi tipo IIS restrikcijomis, leidžiančiomis apskaičiuojamai ir efektyviai sujungti fragmentus vektoriuose.
• Gateway® sistema: rekombinacinis sisteminis klonavimas, patogus perklodinėjimui tarp vektorių be restrikcinių fermentų kiekvieną kartą.
• CRISPR/Cas pagrįsti metodai: naudojami tiek genominiam redagavimui, tiek klonavimo tikslų realizavimui įdiegus DNR tikslinėse vietose.

Vektoriai ir pasirinkimo žymenys

Vektoriai yra nukleorūgščių nešėjai, kuriuos parenkant būtina atsižvelgti į dydį, kopijų skaičių, selekcijos žymenis ir ekspresijos kontrolę. Dažniausiai naudojami vektoriai:

• Plazmidai: lengvai manipuliuojami ir plačiai naudojami E. coli bei kitiems mikroorganizmams.
• Faginiai ar bakteriofagai: naudingi didesniems fragmentams ar bibliotekų sudarymui.
• Virusiniai vektoriai: adenovirusai, lentivirusai ir kt. – naudojami gyvų audinių ar smegenų tyrimams bei terapijai.
• Ekspresijos vektoriai: turi promotorus, ribosominio tvirtinimosi vietas ir signalines sekas, skirtas baltymų gamybai.

Pasirinkimo ir atrankos žymenys dažnai apima antibiotikų atsparumo genus, fluoroforų žymes ar metabolinius žymenis, leidžiančius atskirti sėkmingai transformuotas ląsteles.

Šeimininkai

Nors laboratorinė E. coli yra vienas iš pagrindinių šeimininkų dėl paprasto auginimo ir greitos dauginimosi galimybės, kiti šeimininkai yra svarbūs konkretiems tikslams:

• Yeast (Saccharomyces cerevisiae) – sudėtingesnė baltymų modifikacija ir eukariotinė ekspresija.
• Insektų ląstelių sistemos (pvz., baculovirusai) – sudėtingų eukariotinių baltymų sintezė.
• Žinduolių ląstelės (HEK293, CHO) – reikalingos medicininei baltymų gamybai ir terapiniams tyrimams.
• Augalai ir gyvūnai – transgeninei linijų kūrimui ir funkciniams tyrimams.

Patikra ir kokybės užtikrinimas

Išsamaus klonavimo darbo dalis – sėkmingų konstrukcijų autentifikavimas. Tai apima:

• PCR ir restrikcinių fragmentų analizę;
• DNR sekvenavimą, kad būtų patvirtinta tikslinė seka ir nebūtų nukrypimų;
• baltymų ekspresijos ir funkcinių tyrimų atlikimą, kai tikslas – baltymo gamyba.

Taikymai

Molekulinis klonavimas turi labai platų pritaikymą:

• Biomedicininiai tyrimai: genų funkcijos identifikavimas, signalinių kelių tyrimai, genų perdavimo studijos.
• Biotechnologija: rekombinantinių baltymų (insulino, monocloninių antikūnų) gamyba.
• Genų terapija ir vakcinų kūrimas: vektorių panaudojimas genų perdavimui pacientams.
• Aplinkos ir pramonės taikymai: mikroorganizmų, sugebančių skaidyti teršalus ar gaminti biokurą, kūrimas.
• Biologinių bibliotekų ir genominės analizės: klonavimas naudojamas bibliotekų sudarymui, sekų ekraneimui ir pan.

Etiniai ir saugos aspektai

Molekulinis klonavimas suteikia didelę galingąsias galimybes, todėl taikoma griežta laboratorinė biosaugos ir bioetikos priežiūra. Darbo metu taikomos biosaugos klasės, atliekami rizikos vertinimai, o klininiai taikymai reikalauja reguliavimo ir etinių leidimų. Tyrėjai privalo užtikrinti, kad GMO nepatektų į aplinką be tinkamos kontrolės ir kad medicininės taikymo srities procedūros atitiktų pacientų saugumą ir teisinę bazę.

Santrauka

Molekulinis klonavimas – tai metodų rinkinys, leidžiantis selektyviai išskirti, pakeisti ir dauginti DNR fragmentus bei analizuoti ar panaudoti jų produktus mokslui, medicinai ir pramonei. Nors technologijos vystosi (Gibson, Golden Gate, CRISPR ir kt.), pagrindiniai principai – fragmento išskyrimas, įterpimas į vektorių, transformacija į šeimininką ir atranka – išlieka esmė. Tinkamai taikomas ir reguliuojamas, molekulinis klonavimas yra nepakeičiamas įrankis modernioje biologijoje.

Klausimai ir atsakymai

K: Kas yra molekulinis klonavimas?

K: Kaip vyksta molekulinio klonavimo procesas?

K: Kas yra šiuose klonuose?

K: Kiek bakterijų ląstelių galima paskatinti priimti ir dauginti vieną rekombinantinę molekulę?

K: Kas atsitinka, kai ši viena ląstelė replikuojasi?

Klausimas: Ar yra skirtumas tarp "rekombinantinio" ir "molekulinio klonavimo"?

Paieška pagal raidę