CRISPR: prokariotų imuninė sistema ir genų redagavimas
Sužinokite, kaip CRISPR — prokariotų adaptyvioji imuninė sistema — leidžia tiksliai redaguoti genus ir atveria naujas viltis kovai su virusinėmis ligomis.
CRISPR yra mikrobiologijoje vartojamas terminas. Jis reiškia "Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats" (klasterizuoti taisyklingai išsidėstę trumpi palindrominiai pasikartojimai). Tai natūralus genetinio kodo segmentas, aptinkamas prokariotuose: jį turi dauguma bakterijų ir archėjų. Šios sekos atrodo kaip pasikartojančios trumpų nukleotidų eilutės, tarp kurių yra unikalūs tarpai — vadinamieji spaceriai, kilę iš virusų ar plazmidžių DNR fragmentų.
CRISPR turi daug trumpų pasikartojančių sekų. Šios sekos yra prokariotų adaptyviosios imuninės sistemos dalis. Ji leidžia jiems įsiminti ir pasipriešinti kitiems juos medžiojantiems organizmams, pavyzdžiui, bakteriofagams. Kai bakteriją užkrečia virusas, sistema gali įterpti trumpą viruso DNR fragmentą kaip naują spacerį — taip susiformuoja „įrašas“ apie ankstesnę infekciją.
Kaip tai veikia prokariotams
CRISPR imuninė sistema veikia trimis pagrindiniais etapais:
- Adaptacija (įrašymas): dalys viruso DNR nukopijuojamos ir integruojamos tarp pasikartojimų kaip nauji spaceriai.
- Ekspresija: CRISPR locus transkribuojamas į ilgo DNR segmentą, kuris vėliau yra apdorojamas į trumpus CRISPR RNR (crRNA), kiekvienas turintis spacerio seką, atpažįstančią užpuoliko DNR.
- Interferencija: crRNA kartu su Cas baltymais (CRISPR susiję baltymai) atpažįsta ir nukerpa užpuoliko genetinę medžiagą, neutralizuodami grėsmę. Daugeliu atvejų atpažinimas priklauso nuo šalia tikslo esančios trumpų nukleotidų sekos, vadinamos PAM (Protospacer Adjacent Motif).
Kas yra Cas baltymai ir tipai
CRISPR sistema nėra tik pasikartojimai — svarbūs ir Cas baltymai. Skirtingos prokariotų rūšys turi skirtingas CRISPR–Cas klases ir tipus (pvz., I, II, III). Vienas gerai žinomų baltymų yra Cas9 (iš II tipo sistemos), kuris veikia kaip "molekulinės žirklės" DNR tiksliniam pjovimui. Yra ir kitų Cas baltymų, pavyzdžiui, Cas12, Cas13 — pastarasis nukreiptas į RNR, todėl praverčia virusams, kurių genomą sudaro RNR.
Pritaikymas genų redagavime
CRISPR–Cas technologija buvo pritaikyta kaip galingas įrankis genetinėje modifikacijoje. Pagrindiniai taikymo būdai:
- Genų išjungimas: CRISPR sukuria DNR dvigubą lūžį tiksline vietoje; ląstelė taisydama šį lūžį dažnai sukelia mutacijas, kurios inaktyvuoja geną.
- Genų redagavimas (įterpimas arba korekcija): naudojant donorinę DNR ir ląstelės taisymo mechanizmus galima įterpti arba pakeisti specifines sekas.
- Base editing ir prime editing: naujesni metodai leidžia atlikti vieno nukleotido pakeitimus arba tikslų redagavimą be dvigubo DNR lūžio.
Medicininės, žemėsūkio ir diagnostikos taikymai
- Medicinoje tiriamos galimybės gydyti paveldimas ligas (pvz., kai kurias kraujo ligas), taip pat kovoti su virusinėmis infekcijomis; ieškoma saugių ir efektyvių pristatymo būdų organizme.
- Žemės ūkyje CRISPR naudojama augalų ir gyvūnų veislei tobulinti — įgalina atsparumą ligoms, pagerina derlių ar maistinių medžiagų sudėtį.
- Diagnostikoje su Cas13 ir kitais baltymais sukurti greiti, jautrūs testai (pvz., SHERLOCK, DETECTR), skirti virusams ir kitiems patogenams aptikti.
Iššūkiai ir etika
Nors CRISPR leidžia tiksliai redaguoti genomą, yra svarbių apribojimų ir rizikų:
- Off-target efektai: netikslingi pjūviai gali sukelti nenorimas mutacijas.
- Pristatymas į ląstelę: reikia patikimų vektorių (pvz., virusinių vektorių, lipošomų, nanodalelių), kurie saugiai pristatytų redagavimo kompleksus į reikiamas ląsteles ar audinius.
- Imuninė reakcija: kai kurie Cas baltymai gali sukelti imuninį atsaką žmogaus organizme.
- Etiniai klausimai: genų redagavimas ypač jautrus, kai kalbama apie žmogaus ląsteles, ypač gemalines ląsteles (pirminius genominius pokyčius, kurie perduodami palikuonims). Reikia aiškių reguliavimo mechanizmų ir visuomeninės diskusijos.
Trumpa istorija ir atradimai
CRISPR sekos pirmąkart aprašytos 1987 m., o ryšys su imunitetu ir funkcija paaiškėjo tik vėlesniais dešimtmečiais. 2012 m. Jennifer Doudna, Emmanuelle Charpentier ir jų komandos parodė, kad Cas9 su vadovaujančia RNR galima valdyti kaip universalias molekulines žirkles — tai atvėrė plačias genų redagavimo galimybes ir paskatino sparčią šios srities plėtrą.
Ateities perspektyvos
CRISPR technologija toliau vystoma: tobulinami Cas baltymai mažesniam off‑target poveikiui, kuriami geresni pristatymo metodai, pritaikomos naujos redagavimo strategijos (pvz., prime editing). Be to, plečiasi panaudojimas ne tik medicinoje ar žemės ūkyje, bet ir biotechnologijose bei ekologijoje (pvz., invazinių rūšių kontrolė). Svarbu, kad plėtra vyktų kartu su atsakingu reglamentu ir etikos standartais.
Santrauka: CRISPR yra natūrali prokariotų imuninė sistema, kurios komponentai buvo pritaikyti kaip galingas įrankis genų redagavimui. Ji keičia biologijos ir medicinos galimybes, bet kartu kelia techninių, saugumo ir etinių iššūkių.
CRISPR lokuso schema. Yra trys pagrindinės dalys. 1. cas genai, 2. vedančioji seka ir 3. pasikartojančių tarpų masyvas. Trijų sudedamųjų dalių išdėstymas ne visada yra toks, kaip parodyta paveikslėlyje.
Kaip tai veikia
Po kiekvieno pasikartojimo eina trumpi "tarpinės DNR" segmentai, atsiradę po ankstesnio sąlyčio su bakterijų virusu ar plazmide. CRISPR tarpinė DNR atpažįsta ir suskaido svetimus genetinius elementus panašiai kaip RNR interferencija eukariotiniuose organizmuose.
Iš tikrųjų tarpinės dalys yra virusų, kurie anksčiau bandė atakuoti ląstelių liniją, DNR fragmentai. Užsienietiškas tarpelių šaltinis mokslininkams buvo ženklas, kad CRISPR/cas sistema gali atlikti tam tikrą vaidmenį bakterijų adaptaciniame imunitete.
Faktinį pjaustymą atlieka nukleazė, vadinama Cas9. Cas9 turi dvi aktyvias pjovimo vietas, po vieną kiekvienai DNR dvigubos spiralės srovei. Cas9 tai atlieka išvyniodama svetimą DNR ir tikrindama, ar ji yra komplementari 20 bazinių porų tarpinės RNR (tarpinės srities RNR). Jei taip, svetima DNR susmulkinama.
Programos
Ši technologija buvo naudojama žmogaus ląstelių linijų ir ląstelių genams išjungti, Candida albicans bakterijoms tirti, mielėms, naudojamoms biokurui gaminti, modifikuoti ir pasėlių veislėms genetiškai modifikuoti.
Klausimai ir atsakymai
K: Ką reiškia CRISPR?
A: CRISPR reiškia Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats (klasterizuoti taisyklingai išsidėstę trumpi palindrominiai pasikartojimai).
K: Kur randamas CRISPR?
A: CRISPR yra prokariotų, kuriems priklauso dauguma bakterijų ir archėjų, genetiniame kode.
K: Koks buvo CRISPR atradimo tikslas?
A.: CRISPR atradimo tikslas buvo suprasti jo struktūrą ir funkciją kaip apsaugą nuo virusų atakų.
K: Kaip veikia CRISPR?
A: CRISPR veikia turėdamas trumpas pasikartojančias sekas, kurios veikia kaip prokariotų adaptyvioji imuninė sistema, leidžianti jiems įsiminti ir atremti juos medžiojančius bakteriofagus. Taip bakterijoms suteikiamas įgytas imunitetas.
K: Ką galima padaryti naudojant CRISPR?
A: Naudodami CRISPR mokslininkai gali keisti beveik bet kurio organizmo genus ir naudoti jį kaip priemonę genams iškirpti ir įterpti atliekant genetinę modifikaciją (GM). Be to, atliekami moksliniai tyrimai, siekiant rasti būdų, kaip juos galima panaudoti žmonių virusinėms ligoms gydyti (genų terapija).
K.: Kada buvo atrastas CRISPR?
A: CRISRP buvo atrastas XXI amžiuje.
Ieškoti