siRNA (mažoji interferuojančioji RNR) — kas tai ir kaip veikia

Mažoji interferuojančioji RNR (siRNA) - tai 20-25 bazių porų ilgio dvigubos grandinės RNR molekulių klasė.

siRNA atlieka daugybę vaidmenų, tačiau labiausiai ji pastebima RNR interferencijos (RNRi) kelyje, kur trikdo tam tikrų genų raišką. Genai paveikiami tik tuo atveju, jei jų nukleotidų sekos yra komplementarios siRNA sekoms.

siRNA veikia skaidydama mRNA po transkripcijos. Tai užkerta kelią geno transliacijai į baltymą. siRNA taip pat veikia su RNR susijusiose grandyse, pvz., kaip antivirusinis mechanizmas arba formuojant genomo chromatino struktūrą. Šių kelių sudėtingumas dar tik dabar aiškėja.

Kaip susidaro siRNA

Endogeninės arba eksogeninės ilgos dvigubos grandinės RNR (dsRNR) yra suskaldomos fermento Dicer į maždaug 20–25 nukleotidų ilgio dvigubas grandines — tai ir yra siRNA. Šios dvigubos grandinės paprastai turi 2 nukleotidų 3' galų iškilas, kurios yra svarbios tolimesniam apdorojimui ir RISC komplekso atpažinimui.

Veikimo mechanizmas (žingsniai)

• Įkrovimas į RISC: dviguba siRNA yra įkelta į RISC (RNA-induced silencing complex). Viena iš grandinių — vadinamoji gido arba „guide“ grandinė — išlieka komplekse, o kita (passenger) dažniausiai pašalinama arba suardoma.
• Vado grandinės pasirinkimas: thermodinaminė asimetrija ir 5' bazės tipas lemia, kuri grandinė taps guide. Teisingas pasirinkimas užtikrina tikslų taikinio atpažinimą.
• Tikslo atpažinimas: guide grandinė hibridizuojasi su komplementaria mRNA sekcija — svarbi yra vadinamoji „seed“ sritis (pozicijos ~2–8 nuo 5' galo), kuri lemia specifinį pavienio vietos atpažinimą.
• mRNA skaidymas: jei hibridizacija yra pakankamai tiksliai komplementari, Argonautos baltymas (Ago) RISC komplekse nukloja mRNA, kas leidžia greitai sumažinti taikinio baltymo sintezę.

Skirtumai tarp siRNA ir miRNA

• siRNA paprastai yra griežtai komplementarios savo taikiniui ir sukelia tiesioginį mRNA skaidymą. miRNA dažnai turi neišsamų atitikimą ir daugiausia reguliuoja daugelio genų raišką slopindamos transliaciją arba skatinamos mRNA degredaciją per kitus mechanizmus.
• siRNA dažniausiai kilę iš eksogeninės ar laboratorijoje sintetinamos dvigubos RNR, o miRNA – iš endogeninių genominių šaltinių per pri-miRNA ir pre-miRNA intermedijus.

Praktinis pritaikymas ir terapija

siRNA tapo svarbiu įrankiu tiek moksliniuose tyrimuose, tiek medicinoje:

• Tyrimuose: trumpieji siRNA naudojami genų „nutildymui“ ląstelėse ar organizmuose, tai greitas būdas ištirti geno funkciją. Yra didelės siRNA bibliotekos aukštojo našumo ekranavimui.
• Terapijoje: keli siRNA vaistai jau patvirtinti klinikinėje praktikoje, pavyzdžiui, patisiran (Onpattro) ir inclisiran (Leqvio). Patisiran yra teikiamas lipidinių nanodalelių forma, inclisiran – kaip kepenų nukleotidų (GalNAc) junginys, orientuotas į hepatocitus.
• Antivirusiniai ir augalų taikymai: augalai ir kai kurie bestuburiai naudoja RNRi kaip natūralų antivirusinį mechanizmą; laboratorijose siRNA taip pat taikomi virusų tyrimams.

Dizainas, stabilizacija ir pristatymas

Efektyviam ir saugiam siRNA naudojimui būtini keli elementai:

• Dizaino taisyklės: optimalus ilgis ~21 nukleotidas, 2 nt 3' iškilas, vengti sekų, kurios sutampa su kitais genais (palikti mažai vietos off‑target efektais), atsižvelgti į seed regioną.
• Cheminės modifikacijos: 2'-O‑metilo, 2'-fluoro, fosforotioato jungtys ir kitos modifikacijos didina stabilumą kraujyje, mažina imuninę reakciją (pvz., TLR aktyvavimą) ir gerina farmakokinetiką.
• Pristatymo metodai: lipidinės nanodalelės (LNP), GalNAc konjugatai (kepenių taikymui), virusinės vektoriaus sistemos, nanopartikulės, tiesioginės injekcijos į audinį ar elektroporacija in vitro. Pristatymas į konkrečius audinius ir ląstelių tipus – viena didžiausių kliūčių terapiniam taikymui.

Pavojai ir apribojimai

• Off‑target efektai: dalinis atitikimas gali slopinti nenorimus genus, todėl svarbu kruopščiai tikrinti dizainą in silico ir eksperimentais.
• Imuninė aktyvacija: eksogeninės dvigubos RNR molekulės gali sukelti interferono atsaką per TLR7/8 ar kitus receptorius; cheminės modifikacijos ir pristatymo būdai gali sumažinti šį poveikį.
• Sukeliamo poveikio trukmė ir įvedimo dažnumas: skirtingi pristatymo metodai ir modifikacijos lemia skirtingą siRNA stabilumą organizme, todėl gali prireikti pasikartojančių dozių.
• Sąveika su endogenine RNRi mašina: didelė eksogeninių siRNA apkrova gali varžyti natūralų miRNA kelią ir turėti nenuspėjamų pasekmių.

Praktiniai patarimai laboratorijoje

• Naudokite kelias skirtingas siRNA sekas tam pačiam genui, kad įsitikintumėte, jog stebimas fenotipas nėra off‑target.
• Visada taikykite tinkamus kontrolinius siRNA (neitinantį arba su mutantine seka) ir patikrinkite slopinimo lygį tiek mRNA, tiek baltymo lygyje.
• Apsvarstykite chemines modifikacijas ir pristatymo metodą atsižvelgdami į ląstelių tipą ir in vivo modelį.

siRNA technologija sparčiai vystosi: gerėja dizaino algoritmai, pristatymo sistemas ir saugumo profiliai, todėl tikėtina, kad ateityje matysime daugiau siRNA pagrindu veikiančių terapijų ir tikslesnių genų reguliavimo priemonių.

Klausimai ir atsakymai

K: Kas yra siRNA?

K: Koks svarbiausias siRNA vaidmuo?

K: Kaip siRNA veikia genus?

K.: Kokią funkciją siRNA atlieka skaidydama mRNA?

K: Kur dar be RNRi kelių veikia siRNA?

K.: Kokią reikšmę turi sudėtingi keliai, kuriuose dalyvauja siRNA?

Paieška pagal raidę