Selekcinis žymeklis: genų reporteris, atsparumo genai ir atranka

Selekcinis žymeklis: sužinokite apie genų reporterį, atsparumo genus ir atrankos metodus bakterijoms bei ląstelių kultūroms, identifikuojant sėkmingas transformacijas.

Pasirenkamasis žymeklis - tai genas reporteris, įterptas į ląstelę kartu su įterptu genu. Tai reiškia, kad eksperimentatorius gali nustatyti, ar ląstelėje yra tinkamas genas, nes žymeklis yra matomas arba aptinkamas. Kartais pasirenkamasis žymeklis iš tikrųjų yra reporteris (pvz., fluorescuojantis baltymas), kartais – „atsparumo“ genas, leidžiantis ląstelei išgyventi tam tikrose sąlygose. Abu tipai palengvina transformacijos ar transfe­kcijos sėkmės patikrinimą.

Dažniausiai tai naudojama bakterijoms arba ląstelių kultūroms. Selekciniai žymenys parodo transfekcijos ar kitos procedūros, skirtos svetimos DNR įvedimui į ląstelę, sėkmę. Tai genų nukreipimo ir genų išstūmimo metodas. Svarbu atskirti trumpalaikes (transientines) transfe­kcijas, kur žymeklis rodo tik laikiną ekspresiją, nuo stabilios integracijos į genomo regioną — pastaruoju atveju atrinktos ląstelės ar kolonijos išlaiko žymeklio ekspresiją ilgiau.

Selekciniai žymenys dažnai yra atsparumo antibiotikams genai; bakterijos, kurioms buvo atlikta svetimos DNR įvedimo procedūra, auginamos terpėje, kurioje yra antibiotikų. Antibiotikas sunaikina ląsteles, neturinčias atsparių žymenų. Tos bakterijų kolonijos, kurios gali augti, sėkmingai įsisavino ir išreiškė įvestą genetinę medžiagą. Laboratorinėje praktikoje parenkama antibiotiko koncentracija ir eksperimentinės sąlygos, kad būtų optimizuotas skirtumas tarp transformuotų ir netransformuotų ląstelių.

Alternatyva pasirenkamajam žymekliui yra atrankinis žymeklis, kuris leidžia tyrėjui atskirti norimas ir nepageidaujamas ląsteles. Atrankiniai (screenable) žymenys nesuteikia išgyvenimo pranašumo, bet yra lengvai aptinkami — pavyzdžiui, fluorescencijos ar fermento aktyvumo pagalba. Dažnai eksperimentuose naudojami abu tipai kartu: selekcijai parenkamos atskiros ląstelės, o reporteris leidžia įvertinti ekspresijos lygį ar lokalizaciją.

Kiti svarbūs aspektai

- Selektavimo metodai: plokštelinė auginimo atranka (ant agarinių terpių su antibiotiku), skystųjų kultūrų selekcija, sėklų/augalų herbicidų atranka, bei ląstelių atranka eFACS/flow cytometry pagal fluorescenciją.
- Reporteriai: žalio fluorescencinio baltymo (GFP) ir jo variantų naudojimas leidžia tiesiogiai stebėti ląsteles mikroskopu arba srauto citometru; luciferazės naudojamos jautrioms luminescencinėms analizėms; β-galaktozidazė (lacZ) ir β-glukuronidazė (GUS) – enziminiai reporteriai, kurių aktyvumą galima spalvinti reagento pagalba.

Rizikos, trūkumai ir alternatyvos

- Netikri teigiami rezultatai gali atsirasti, jei plazmidai nėra pašalinti arba žymeklis veikia be įterpto tikslo geno. Reikia patvirtinti transformacijas PCR, sekoskaita arba funkciniais testais.
- Atsparumo genai, ypač antibiotikams, kelia biosaugos ir reguliavimo rūpesčius, ypač dirbant su aplinkai jautriomis sistemomis ar komercinėmis linijomis. Dėl to vystomos žymeklių pašalinimo (marker removal) technologijos, pvz., Cre-lox, Flp-FRT, arba naudojami marker-free metodai ir auxotrofinės atrankos sistemos (pvz., URA3, HIS3 mielėse).
- Kartais reikia optimizuoti žymeklio ekspresiją (promoterius, kopijų skaičius) ir atrankos sąlygas (antibiotiko koncentracija, gydymo trukmė), kad sumažinti falskų atrankų skaičių.

Pasirenkamų žymeklių pavyzdžiai:

• Antibiotikams atsparūs genai: ampR/bla (ampicilino, β-laktamazių atsparumas), kanR/neo (kanamicinas/neomicinas; eukariotams - G418), tetR (tetraciklinui), cat (chloramfenikolio acetiltransferazė).
• Eukariotinių ląstelių selekcija: neo (G418), hyg (hygromycin B), puro (puromicinas), bsd (blasticidin) — naudojami selekcijai kultūrose ir stabiliai transformuotose ląstelių linijose.
• Herbicidų atsparumo genai: bar (fotosfinofticinės/glufosinato atsparumas) — dažnas augalų transformacijose.
• Reporteriai (screenable): GFP ir jo variantai (fluorescencija), luciferazės (luminescencija), lacZ (β-galaktozidazė), GUS (β-glukuronidazė) — naudojami ekspresijos stebėjimui, lokali­zacijai ir kiekybiniams tyrimams.
• Auxotrofiniai žymekliai: URA3, HIS3 ir panašūs — dažnai naudojami mielių ir kitų modelinių organizmų genetikoje, kai selekcija vykdoma pagal maistines sąlygas.
• Kontra‑seleciniai (counter‑selection) žymekliai: sacB (leidžia naikinti ląsteles tam tikromis sąlygomis) arba URA3 su 5‑FOA — naudojami žingsniams, kai reikia pašalinti žymeklį iš geno vietos.

Įprasta praktika — po atrankos patvirtinti teigiamus klonus papildomais metodais (PCR, sekoskaita, proteininiais ar fenotipiniais testais) ir pagal poreikį pašalinti selekcinius žymeklius, jei tai reikalinga saugumo ar reguliavimo priežasčių. Tokiu būdu užtikrinama, kad atrinktų ląstelių savybės atitinka tyrimo tikslus ir mažinamas nepageidaujamų artefaktų arba biologinės rizikos pavojus.

Klausimai ir atsakymai

K: Kas yra pasirenkamasis žymeklis?

K.: Kokių tipų ląstelėms dažniausiai naudojamas pasirenkamasis žymeklis?

K: Kokia yra pasirenkamųjų žymenų paskirtis?

K: Kokiu būdu naudojami pasirenkamieji žymenys?

K: Koks yra atrenkamų žymenų pavyzdys?

K: Kaip atsparumo antibiotikams genas veikia kaip pasirenkamasis žymeklis?

Klausimas: Kas yra alternatyva pasirenkamajam žymeniui?

Paieška pagal raidę