Transfekcija: DNR ir RNR įvedimas į ląsteles — apibrėžimas ir panaudojimas

Transfekcija: sužinokite, kaip DNR ir RNR įvedimas į ląsteles keičia genų raišką, pritaikymai genų terapijoje, audinių kultūrose ir biomedicinos tyrimuose.

Transfekcija - tai procesas, kurio metu į ląsteles sąmoningai įvedama DNR arba RNR. Šis žodis sudarytas iš žodžių transformacija ir infekcija. Terminas vartojamas:

1. Bakterijų ląstelių transformacija virusų nukleorūgštimis
2. Gyvūnų ląstelių transformacija audinių kultūroje naudojant išgrynintą DNR. DNR pridedama prie ląstelių genomo.
3. Ląstelių ar embrionų transformacija naudojant viengrandę ar dvigrandę RNR. Taip sukuriami tam tikri baltymai arba nutildomi tam tikri genai.
4. Genų terapija naudojant modifikuotą virusą kaip vektorių.

Transfekcija gali sukelti netikėtų tikslinių ląstelių morfologijų ir pakitimų. Transfekcija RNR molekulėmis sukelia pokyčius, kurie negali būti visam laikui perduodami ląstelių linijoje.

Metodai

Yra kelios transfekcijos technikos, kurių pasirinkimas priklauso nuo ląstelių tipo, įvedamos nukleorūgšties tipo ir tyrimo tikslų. Dažniausiai naudojamos:

• Cheminės medžiagos (pvz., kalcio fosfatas) – pigus metodas bakterijoms ir kai kurioms eukariotų ląstelėms.
• Liposomos ir lipidiniai reagentai (lipofekcija) – lipido pavidalo kompleksai apsaugo DNR/RNR ir palengvina jų patekimą per ląstelės membraną; plačiai naudojama kultūruojamoms gyvūnų ląstelėms.
• Elektroporacija – trumpas stiprios elektrinės srovės impulsas, kuris sukuria laikinas membranos poras; tinka tiek prastai transfekuojamoms ląstelėms, tiek bakterijoms.
• Mikroinjekcija – tiesioginė nukleorūgšties injekcija į ląstelės branduolį ar citoplazmą; naudojama embrionų manipuliacijose ir specifiniuose tyrimuose.
• Virusiniai vektoriai – adenovirusai, lentivirusai ir kiti modifikuoti virusai efektyviai perneša genetinę medžiagą į daugumą ląstelių; svarbu atsižvelgti į saugumo ir integracijos riziką.
• Nanopartikulės ir kitos pažangiosios platformos – polimerai, aukso nanodalelės ir kt., naudojamos specifiniam DNR/RNR pristatymui in vitro ir in vivo.

Transientinė (laikinė) ir stabili transfekcija

Transientinė transfekcija reiškia, kad įvesta DNR ar RNR neveikia visam ląstelių padermiui — genų ekspresija trunka ribotą laiką (dažnai kelias dienas). Tai plačiai naudojama greitai išreikšti baltymus ar atlikti trumpo laikotarpio funkcines analizes. Stabili transfekcija susidaro, kai DNR integruojasi į genomą arba kai naudojami selekciniai žymenys, leidžiantys išsirinkti ilgam perduodamas ląstelių linijas.

Panaudojimas

• Tyrinėti genų funkciją ir reguliaciją (ekspresijos analizės, promotorų tyrimai).
• Gauti rekombinantinius baltymus ir žymėtas baltymus farmakologiniams ir analizės tikslams.
• Nutildyti genus naudojant siRNA ar shRNA — RNAi technologijos.
• Genome redagavimo įrankių (pvz., CRISPR–Cas) pristatymas į ląsteles.
• Vakcinų ir genų terapijos vystymas, kur genetiškai modifikuotos dalelės arba vektoriai pateikia antigenus ar gydomus genus.

Veiksniai, lemiantys efektyvumą

Transfekcijos sėkmę lemia:

• ląstelių tipas ir jų fiziologinė būsena (konfluencija, proliferacijos fazė);
• nukleorūgšties dydis, forma (plazmidinė DNR, linijinė DNR, ssRNA arba dsRNA) ir kokybė;
• parinktas metodas ir reagentų santykis su DNR/RNR;
• aptarnavimo sąlygos (serumo kiekis terpėje, antibakteriniai preparatai);
• inkubacijos laikas ir pooperacinė priežiūra (pvz., laiko pasirinkimas prieš tikrinant ekspresiją).

Kontrolės ir sauga

Atliekant transfekcijas svarbu naudoti tinkamas kontrolines grupes: neperneštas ląsteles, „tuščio“ vektoriaus kontrolę, teigiamus ir neigiamus kontrolinius plasmidus ar RNR. Virusinių vektorių atveju būtinos biosaugos procedūros ir atitinkamos laboratorinės sąlygos. Taip pat reikia apsvarstyti galimas nepageidaujamas pataisas genome ir imuninius atsakus in vivo tyrimuose.

Patikra ir analizė

Po transfekcijos dažnai atliekamos:

• PCR arba qPCR – genetinės medžiagos aptikimui ir kiekybei įvertinti;
• Western blot, ELISA arba imunofluorescencija – baltymų ekspresijos patikrai;
• Fluorescencinės baltymų žymos (pvz., GFP) – tiesioginiam ekspresijos stebėjimui;
• Funkciniai testai – norimos fenotipo ar biocheminių kelyje pokyčių įvertinimui.

Potencialios pasekmės ir apribojimai

Transfekcija gali sukelti ląstelių morfologinius ir fiziologinius pakeitimus, streso atsakus arba netolygų ekspresijos lygį tarp ląstelių populiacijos. DNR transfekcija gali lemti atsitiktinę integraciją į genomą su mutageneze rizika; RNR transfekcija dažniausiai sukelia laikinas pasekmes, kurios nepaveldimos per ląstelių padalijimus. Todėl būtina interpretuoti rezultatus atsižvelgiant į galimas nepageidaujamas įtakos priemones ir atlikti papildomas kontrolines analizes.

Santrauka: Transfekcija yra universalus ir plačiai naudojamas įrankis molekulinėje biologijoje, leidžiantis kontroliuoti genų ekspresiją ir tirti baltymų funkcijas. Tinkamai parinkus metodą, reagento sąlygas ir kontrolines priemones, galima gauti patikimus ir pakartojamus rezultatus, tačiau būtina atidžiai vertinti saugą ir galimų artefaktų įtaką.

Klausimai ir atsakymai

K: Kas yra transfekcija?

K: Kaip sudaromas terminas "transfekcija"?

K: Kokios yra skirtingos transfekcijos rūšys?

K: Kas atsitinka, kai transfekcijos metu į ląstelių genomą pridedama DNR?

K.: Ar pokyčiai, atsiradę transfekcijos metu naudojant RNR molekules, gali būti visam laikui perduodami ląstelių linijai?

K: Ką gali sukelti transfekcija?

K: Koks genų terapijos tikslas naudojant modifikuotą virusą kaip vektorių?

Paieška pagal raidę