ELISA – fermentais susietas imunosorbentinis tyrimas: apibrėžimas ir taikymai
ELISA — fermentais susietas imunosorbentinis tyrimas: sužinokite metodo principus, diagnostiką, praktinius taikymus ir jautresnę ELISPOT alternatyvą medicinai bei mokslui.
ELISA (su fermentais susietas imuno‑sorbentinis tyrimas, kartais sutrumpintai vadinamas EIA) yra biochemijos metodas, naudojamas nustatyti, ar mėginyje yra tam tikros medžiagos — pavyzdžiui, specifinio citokino, antigeno arba antikūnų. Metodo pagrindas — specifinis antigeno ir antikūno sąveikos fiksavimas bei fermento sukeltos signalo generavimas, kuris leidžia kiekybiškai arba kokybiškai įvertinti tiriamą medžiagą.
Metodo principas
ELISA remiasi dviejų elementų deriniu: specifiniu antigeno–antikūno ryšiu ir fermento, prijungto prie antikūno (arba antigėno), katalizuotu reakcijos signalu. Kai prie immobilizuoto antigens arba antikūno prisijungia žymėtas reagentas, pridėjus substratą fermentas sukelia spalvos pokytį, šviesos emisiją ar fluorescenciją. Signalas matuojamas spektrofotometru, luminometru arba fluorescenciniu skaitytuvu; signalo intensyvumas tiesiogiai koreliuoja su tiriamos medžiagos kiekiu (naudojant koncentracijos standartinę kreivę).
Dažniausi ELISA tipai
- Tiesioginis ELISA — mėginio antigenas fiksuojamas į plokštelę ir tiesiogiai aptinkamas fermentu pažymėtu antikūnu. Paprasta ir greita, bet mažiau jautri.
- Netiesioginis ELISA — fiksuotas antigenas aptinkamas pirminiu antikūnu, o antrinis, fermentu pažymėtas antikūnas prisijungia prie pirmojo, didindamas signalą.
- Sandwich (ūksatas) ELISA — naudojami du antikūnai: imobilizuotas "fiksuojantis" antikūnas pritraukia tikslinį antigeną, o antras, fermentu pažymėtas antikūnas aptinka. Labai jautrus ir specifinis, tinkamas didesniems molekulių kiekiams be taršos fonu.
- Konkurentinis (competitive) ELISA — mėginio antigenas konkuruoja su pažymėtu antigenu dėl riboto antikūno prisijungimo vietų; naudojama mažoms molekulėms ar kai antigeno negalima tiesiogiai įtvirtinti.
Pagrindiniai darbo etapai
- Plokštelės dengimas (coating) imobilizuojant antigeną arba fiksuojantį antikūną.
- Užblokavimas (blocking) – nepageidaujamų prisijungimų mažinimas naudojant baltymų tirpalą (pvz., BSA, pieno baltymus).
- Mėginio inkubacija, leidžiant antigenui ar antikūnui sąveikauti su plokštelėje esančiais reagentais.
- Skalavimas (washes) tarp žingsnių, kad būtų pašalintos nespecifinės molekulės.
- Pridėti fermentu pažymėtą aptikimo reagentą ir inkubuoti.
- Substrato pridėjimas — susidaro matomas signalas (spalva, šviesos emisija arba fluorescencija).
- Skaitymas ir duomenų interpretacija pagal standartinę kreivę.
Dažniausi reagentai ir detekcijos būdai
- Fermentai: horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP).
- Substratai: TMB, ABTS, pNPP (spalvos keičiasi ir matuojami optiniu tankiu), taip pat chemiluminescenciniai ir fluorescenciniai substratai.
- Detekcija: kolorimetrija (optinis tankis), chemiluminescencija (neryškesnis fonas, didesnė jautrumas), fluorescencija (multikomponentinė analizė).
Jautrumas, kiekybinimas ir kontrolė
ELISA leidžia tiek kokybinį (teigiamas/neigiamas), tiek kiekybinį tyrimą. Kiekybiniam nustatymui būtina standartinė kreivė, gauta iš žinomų koncentracijų standartų. Tyrimo jautrumą ir specifiškumą lemia antikūnų kokybė, reagentų paruošimo sąlygos ir plokštelių apdorojimas. Tyrime būtini teigiami ir neigiami kontroliniai mėginiai bei vidiniai kontrolės mechanizmai, kad būtų išvengta klaidinančių rezultatų (pvz., matavimo interferencijos, matricos efektų ar „hook“ fenomeno labai aukštoms koncentracijoms).
Pritaikymas
- Klininė diagnostika: infekcinių ligų serologija, hormonų (pvz., TSH, insulinų) nustatymas, alergijų tyrimai.
- Moksliniai tyrimai: citokinų, augimo faktorių, baltymų ir kitų biologinių žymenų kiekybinimas iš serumo, plazmos, kultūrinių supernatantų ar audinių lysatų.
- Biotechnologija ir farmacijos pramonė: vakcinų tyrimai, antikūnų gamyba ir kokybės kontrolė.
- Maisto sauga ir aplinkos analizė: toksinų, alergenų ar patogenų žymenų aptikimas.
Privalumai ir trūkumai
- Privalumai: didelis jautrumas ir specifiškumas (ypač sandwich ELISA), santykinai paprasta ir pigi procedūra, galimybė automatizuoti ir apdoroti daug mėginių vienu metu.
- Trūkumai: galimi kryžminių reakcijų artefaktai, matricos interferencija (serumo komponentai, hemolizė, lipemija), prireikus kruopštaus standartizavimo ir validacijos. Kai kuriais atvejais jautrumas prastesnis nei molekulinėms metodikoms (pvz., PCR).
Praktinės pastabos
- Parinkite tinkamą plokštelę (pvz., polistireno dengtas paviršius) ir antikūnų porą tam, kad būtų užtikrinta didžiausia specifika.
- Laikykitės skalavimo ir inkubacijos sąlygų — nepakankamas skalavimas didina foną, per ilgos inkubacijos gali sukelti nepageidaujamą nusėdimą.
- Interpretuodami rezultatus, atsižvelkite į mėginių tipą (serumas, plazma, šlapimas, seilės) ir galimą matricos poveikį.
Sudėtingesnis ir jautresnis metodas — ELISPOT metodas — buvo išvestas iš ELISA metodo; jis leidžia nustatyti atskirų ląstelių gebėjimą gaminti citokinus ar kitas molekules, t. y. vietoje spektrofotometrijos skaitoma signalo vieta ant membranos ir skaičiuojamos pozitvios ląstelės.
Apibendrinant, ELISA yra universalus ir plačiai naudojamas metodas tiek klinikinėje diagnozėje, tiek tyrimuose. Teisingas metodikos pasirinkimas, kontrolės ir standartizavimas yra būtini, kad gauti rezultatai būtų patikimi ir interpretuojami teisingai.
Klausimai ir atsakymai
K: Kas yra ELISA?
A: ELISA reiškia enzimais susietą imuno sorbcinę analizę, kuri yra biochemijos metodas, naudojamas siekiant nustatyti konkrečios medžiagos buvimą mėginyje.
K: Kaip veikia ELISA?
A: ELISA naudoja antikūnus, kurie prisijungia prie tiriamos medžiagos ir sukuria specifinę spalvą, rodančią esančios medžiagos kiekį.
K: Kokias medžiagas galima aptikti ELISA metodu?
A: ELISA gali nustatyti konkrečius citokinus arba antigenus mėginyje.
K: Ką rodo ELISA tyrimo metu susidaręs spalvos kiekis?
A: ELISA tyrimo metu susidaręs spalvos kiekis rodo, kiek mėginyje yra tiriamos medžiagos.
K.: Ar ELISA yra vienintelis metodas, naudojamas konkrečioms medžiagoms mėginyje aptikti?
Atsakymas: Ne, yra sudėtingesnis ir jautresnis metodas, vadinamas ELISPOT metodu, kuris yra išvestinis iš ELISA metodo.
K: Koks yra antrojo antikūnų rinkinio, naudojamo ELISA metodu, vaidmuo?
A: Antroji antikūnų grupė ELISA tyrime naudojama tiriamai medžiagai užfiksuoti, ji prilimpa ir prie medžiagos, ir prie tiriamojo konteinerio, kad išlaikytų medžiagą.
K.: Ar ELISA tyrimas visada parodo spalvą, kai aptinkama medžiaga?
A: Ne visada, kartais medžiagą reikia apžiūrėti ultravioletinėje šviesoje, kad antikūnai sukurtų spalvą.
Ieškoti