Nukreipta evoliucija
Nukreiptoji evoliucija (DE) - tai metodas, naudojamas fermentams gaminti pramoniniais ar medicininiais tikslais.
Šis metodas - tai baltymų inžinerija, kuri imituoja natūralią atranką.
Pagrindinė idėja - pakartotinai mutuoti geną, kad būtų sukurta variantų biblioteka. Atranka išskiria genus, turinčius pageidaujamą funkciją. Jie yra kito raundo šablonas.
Tai galima atlikti in vivo (gyvose bakterijų ar mielių ląstelėse) arba in vitro (laisvai tirpale ar mikrodalelėse).
Išbandžius daugiau mutantų, padidėja tikimybė rasti tokį, kuris pasižymėtų pageidaujamomis savybėmis.
Vykstant evoliucijai in vivo, kiekviena ląstelė (paprastai bakterijos arba mielės) transformuojama su plazmide, kurioje yra skirtingas variantų bibliotekos narys. Ląstelėse skiriasi tik dominantis genas, o visi kiti genai lieka tie patys.
Ląstelės baltymą išreiškia citoplazmoje arba paviršiuje, kur galima patikrinti jo funkciją. Šio formato privalumas yra tas, kad atrenkamos savybės ląstelinėje aplinkoje, o tai naudinga, kai išvystytą baltymą ar RNR norima panaudoti gyvuose organizmuose.
Kai DE atliekama be ląstelių, naudojant in vitro transkripcijos transliaciją, baltymai arba RNR gaminami laisvai tirpale arba dirbtiniuose mikrodalelėse. Tai naudinga tuo, kad galima taikyti daugiau sąlygų (pvz., temperatūrą, tirpiklius). Taip galima išreikšti baltymus, kurie būtų toksiški ląstelėms. Be to, atliekant in vitro evoliucijos eksperimentus galima sukurti daug didesnes bibliotekas (iki 1015), nes bibliotekos DNR nereikia įterpti į ląsteles. Tai dažnai apriboja tai, ką galima padaryti.
Kryptingos evoliucijos pavyzdys, palyginti su natūralia evoliucija. Vidinis ciklas rodo tris kryptingos evoliucijos ciklo etapus, o skliausteliuose - imituojamą natūralų procesą. Išoriniame apskritime pavaizduoti tipinio eksperimento etapai. Raudonais simboliais pažymėti funkciniai variantai, šviesiais simboliais - variantai su sumažinta funkcija
Paveldimumo užtikrinimas
Išskyrus funkcionuojančius baltymus, būtina, kad jų genai taip pat būtų, todėl būtinas genotipo ir fenotipo ryšys.
Tai gali būti kovalentinis būdas, kai mRNA genas su baltymu vertimo pabaigoje sujungiamas puromicinu.
Arba baltymas ir jo genas gali būti laikomi kartu arba emulsijos lašeliuose. Tada išskirtos genų sekos padauginamos PGR arba transformuotomis bakterijomis šeimininkėmis. Kaip šabloną kitam mutagenezės raundui galima naudoti vieną geriausią seką arba sekų grupę. Pasikartojantys diversifikacijos-atrankos-amplifikacijos ciklai sukuria fermentų variacijas, pritaikytas atrankos procesui.
Išreikštas baltymas gali būti kovalentiškai susietas su savo genu (kaip mRNR), kairėje, arba patalpintas tame pačiame skyriuje kartu su juo, dešinėje. Bet kuriuo atveju baltymą koduojantis genas yra izoliuotas.
Skirtas prizas
JAV inžinierė Frances Arnold pelnė Tūkstantmečio technologijų premiją už kryptingos evoliucijos pradžią.
Klausimai ir atsakymai
K: Kas yra kryptinga evoliucija?
Atsakymas: Nukreiptoji evoliucija (DE) - tai metodas, naudojamas fermentams gaminti pramoniniais ar medicininiais tikslais. Tai baltymų inžinerijos forma, kuri imituoja natūralią atranką.
K: Kaip veikia kryptinga evoliucija?
A. Kryptinga evoliucija vyksta geną pakartotinai mutuojant, taip sukuriant variantų biblioteką. Atranka išskiria genus, turinčius pageidaujamą funkciją, kurie vėliau naudojami kaip šablonai kitam raundui.
K: Kur galima vykdyti kryptingą evoliuciją?
A.: Nukreipta evoliucija gali būti vykdoma in vivo (gyvose bakterijų ar mielių ląstelėse) arba in vitro (laisvai tirpale ar mikrodalelėse).
K: Kokie yra kryptingos evoliucijos in vivo privalumai?
A: Vykdant kryptingą evoliuciją in vivo privalumas yra tas, kad atrenkamos savybės ląstelinėje aplinkoje, o tai naudinga, kai išvystytas baltymas ar RNR turi būti naudojamas gyvuose organizmuose.
K: Kokie yra kryptingos evoliucijos in vitro privalumai?
A: Vykdant kryptingą evoliuciją in vitro privalumas yra tas, kad galima sudaryti daugiau sąlygų (pvz., temperatūra, tirpikliai) ir galima išreikšti baltymus, kurie būtų toksiški ląstelėms. Be to, galima sukurti daug didesnes bibliotekas, nes DNR nereikia įterpti į ląsteles.
Klausimas: Kas riboja tai, ką galima daryti atliekant in vitro eksperimentą?
Atsakymas: Tai, ką galima daryti in vitro eksperimento metu, dažnai priklauso nuo to, kiek DNR reikia įterpti į ląsteles.
