Nukreiptoji evoliucija: kas tai yra ir kaip veikia baltymų inžinerija

Nukreiptoji evoliucija (DE) yra praktinis baltymų arba RNR savybių tobulinimo metodas, plačiai taikomas kuriant chemines reakcijas katalizuojančius fermentams, biotechnologinius įrankius ir naujus vaistus. Šis metodas—tai baltymų inžinerija, kuri imituoja natūralią atranką, bet ją vykdo daug greičiau ir konkretesniais tikslais.

Pagrindinė idėja ir darbo eiga

Pagrindinė idėja yra pakartotinai mutuoti geną, kad būtų sukurta didelė variantų biblioteka, ir tuomet atrankos arba tikrinimo (screening) metu išskirti variantus, turinčius pageidaujamą funkciją. Atrinkti geri variantai tampa kito raundo šablonu, ir procesas kartojamas tol, kol pasiekiamas reikiamas efektyvumas arba specifika.

Kaip vyksta mutacijų generavimas

• Atsitiktinė mutagenezė: pavyzdžiui, error-prone PCR, kur dažniau įvedamos atsitiktinės klaidos DNR kopijavimo metu.
• Rekombinacija: DNR maišymas (pvz., DNA shuffling) leidžia sujungti naudingas mutacijas iš skirtingų variantų.
• Sitacinė mutagenezė: tikslinės pakeitimų bibliotekos viename ar keliuose aminorūgščių pozicijose (saturacijos bibliotekos).
• In situ metodai: evoliucijos priemonės, pvz., sistema, leidžianti vykdyti mutacijas ir atranką viename cikle gyvuose organizmuose.

Atranka ir tikrinimas

Atranka gali būti vykdoma dviem pagrindiniais būdais:

• Selektavimas (selection) — tik gyvybingi arba tam tikrą savybę turintys variantai išgyvena arba kaupiasi. Tai ypač naudinga, kai norima, kad baltymas veiktų ląstelėje ar leistų kolonijoms išgyventi tam tikrose sąlygose.
• Tikrinimas / ekranuote (screening) — kiekvieną variantą atskirai testuojame pagal veiklos rodiklius (pvz., aktyvumą, stabilumą), dažnai naudojant automatizuotas platformas.

In vivo evoliucija

Vykstant evoliucijai in vivo, dažnai pasirenkamos bakterijos arba mielės. Paprastai kiekviena ląstelė transformuojama su plazmide, kurioje yra skirtingas bibliotekos narys. Ląstelėse skiriasi tik dominantis genas, o visi kiti genai lieka tie patys. Ląstelės baltymą išreiškia citoplazmoje arba paviršiuje, kur galima patikrinti jo funkciją. Šio formato privalumas yra tas, kad atrenkamos savybės patvirtinamos ląstelinėje aplinkoje — tai ypač naudinga, kai norima, kad išvystytas baltymas ar RNR veiktų gyvuose organizmuose.

In vivo technologijų pavyzdžiai: bakterijų arba mielių paviršiaus ekranuotės, faginės bibliotekos ir PACE (phage-assisted continuous evolution) sistemos, leidžiančios automatiškai vykdyti daugybę evoliucijos ciklų.

In vitro evoliucija

Kai DE atliekama be ląstelių, naudojant in vitro transkripcijos ir transliacijos sistemas, baltymai arba RNR gaminami laisvai tirpale arba dirbtiniuose mikrodalelėse. Tai leidžia taikyti platesnį eksperimentų sąlygų spektrą (pvz., aukštesnę temperatūrą arba organinius tirpiklius), taip pat išreikšti baltymus, kurie būtų toksiški ląstelėms.

In vitro metodai apima ribosomų ekranuotes (ribosome display), mRNA-ekranuotes (mRNA display), bei mikrorezervo ar dropletų mikrodalelių (compartmentalization) sistemas. Be to, atliekant in vitro evoliucijos eksperimentus galima sukurti daug didesnes bibliotekas — iki 10¹⁵ skirtingų variantų — nes bibliotekos DNR nereikia įterpti į ląsteles, kas dažnai riboja galimus dydžius ir įvairovę.

Kada rinktis in vivo arba in vitro?

• In vivo pranašumai: atrinkti baltymai veikia natūralioje ląstelės aplinkoje; tinka, kai svarbu palaikyti sąveikas su kitais ląstelės komponentais.
• In vitro pranašumai: galima naudoti ekstremalias sąlygas, dirbti su toksiškais baltymais ir pasiekti didesnę bibliotekų įvairovę.
• Dažnai geriausi rezultatai gaunami derinant abu metodus — pavyzdžiui, pirmiausia plati in vitro paieška, vėliau optimizavimas in vivo.

Praktinės taikymo sritys

• Pramoniniai fermentai—efektyvesnės ir stabilios katalizės sąlygomis (pvz., aukšta temperatūra, organiniai tirpikliai).
• Medicinos sritis—antikūnų ir vaistų tikslumo didinimas, antibiotikų alternatyvos, vakcinų komponentai.
• Bioremediacija—fermentai, gebantys skaidyti teršalus.
• Sintezinė biologija ir metabolinė inžinerija—cirkuliuojančių kelių optimizavimas medžiagų gamybai.
• Biotechnologiniai tyrimų įrankiai—naujų enzimų ar biosensorinių sistemų kūrimas.

Privalumai ir apribojimai

Privalumai: leidžia pasiekti aukštą specifiką ir aktyvumą be pilno mechanizmo supratimo; greitesnis nei natūralus evoliucinis laikas; pritaikomas daugeliui baltymų ir RNR tipų.

Apribojimai: atrankos sąlygos gali neatitikti galutinės taikymo aplinkos (tai gali duoti geru rezultatu tik laboratorinėse sąlygose); kai kurios savybės (pvz., ilgalaikis stabilumas organizme) sunkiau užtikrinamos vien laboratoriniais testais; taksonominiai ir biosaugos apribojimai, kai dirbama su patogeninėmis rūšimis arba rizikingomis savybėmis.

Saugumo, etikos ir reguliavimo aspektai

Evoliucijos eksperimentai gali generuoti naujas funkcijas, todėl svarbu laikytis biosaugos taisyklių ir etikos principų: vertinti galimą riziką, kontroliuoti biologinių medžiagų naudojimą ir laikytis teisinių reikalavimų. Tiriant galimų panaudojimo scenarijų naudą ir riziką, dažnai reikalingas daugiadisciplinis vertinimas.

Baigiamoji mintis

Nukreiptoji evoliucija yra galinga priemonė, leidžianti greitai ir tikslingai tobulinti baltymus ir RNR. Tinkamai parinkus mutacijų generavimo metodą, atrankos strategiją ir eksperimentinius parametrus, galima sukurti molekules su geresnėmis funkcijomis nei gamtoje rastos versijos. Svarbu atsižvelgti į praktinius apribojimus, saugą ir galimą poveikį, ypač kuriant priemones, skirtas vartoti žmonėms ar leisti į aplinką.

Paveldimumo užtikrinimas

Išskyrus funkcionuojančius baltymus, būtina, kad jų genai taip pat būtų, todėl būtinas genotipo ir fenotipo ryšys.

Tai gali būti kovalentinis būdas, kai mRNA genas su baltymu vertimo pabaigoje sujungiamas puromicinu.

Arba baltymas ir jo genas gali būti laikomi kartu arba emulsijos lašeliuose. Tada išskirtos genų sekos padauginamos PGR arba transformuotomis bakterijomis šeimininkėmis. Kaip šabloną kitam mutagenezės raundui galima naudoti vieną geriausią seką arba sekų grupę. Pasikartojantys diversifikacijos-atrankos-amplifikacijos ciklai sukuria fermentų variacijas, pritaikytas atrankos procesui.

Išreikštas baltymas gali būti kovalentiškai susietas su savo genu (kaip mRNR), kairėje, arba patalpintas tame pačiame skyriuje kartu su juo, dešinėje. Bet kuriuo atveju baltymą koduojantis genas yra izoliuotas.

Klausimai ir atsakymai

K: Kas yra kryptinga evoliucija?

K: Kaip veikia kryptinga evoliucija?

K: Kur galima vykdyti kryptingą evoliuciją?

K: Kokie yra kryptingos evoliucijos in vivo privalumai?

K: Kokie yra kryptingos evoliucijos in vitro privalumai?

Klausimas: Kas riboja tai, ką galima daryti atliekant in vitro eksperimentą?

Paieška pagal raidę