Genomo redagavimas (ZFN, CRISPR): apibrėžimas, metodai ir taikymai

Genomo redagavimas (ZFN, CRISPR): aiškus apibrėžimas, metodų palyginimas ir praktiniai taikymai medicinoje, biotechnologijose bei genų terapijoje.

Genomo redagavimas yra genų inžinerijos rūšis.

DNR įterpiama, pakeičiama arba pašalinama iš genomo naudojant dirbtinai sukurtas nukleazes arba "molekulines žirkles". Nukleazės norimose genomo vietose sukuria specifinius dvigubos grandinės pertrūkius (DSB). Ląstelės mechanizmai natūraliais procesais pataiso sukeltą (-as) lūžį (-is).

Kaip veikia pataisymai: po dvigubos grandinės pertrūkio DNR gali būti atstatyta dviem pagrindiniais keliais:

• NHEJ (Non-Homologous End Joining) – greitas, dažnai klaidingas sujungimas, kuris gali sukelti mažus įterpimus arba ištrynimus (indelius). Tai dažnai naudojama genams "išjungti" (knockout).
• HDR (Homology-Directed Repair) – tikslesnis kelias, kai ląstelė naudoja donorinį DNR šabloną, leidžiantį atlikti konkrečius nukleotidų pakeitimus arba įterpimus. HDR efektyvumas dažnai priklauso nuo ląstelės ciklo fazės ir retai būna dominuojantis suaugusiose ląstelėse.

Šiuo metu naudojamos keturios modifikuotų nukleazių šeimos: meganukleazės, ZFN, TALEN ir CRISPR–Cas sistemos. Kiekviena jų turi savų privalumų ir trūkumų, susijusių su tikslumu, projektuojamumu ir veikimo paprastumu.

Metodai ir jų ypatybės

CRISPR–Cas (ypač Cas9) tapo populiariausia dėl paprastumo: vadovaujamoji gRNA seka nukreipia Cas baltymą į tikslią DNR vietą. Ši sistema yra lengvai programuojama, leidžia greitai testuoti daug tikslų ir pritaikyti įvairioms rūšims. Taip pat išvystytos pažangesnės versijos – base editing (bazinis redagavimas) ir prime editing, kurios leidžia atlikti vieno nukleotido pakeitimus be dvigubos grandinės pertrūkio.

ZFN (zinc-finger nucleases) – tai modifikuotos baltymų faktorių dalys, kurios atpažįsta specifines 3–4 bp sekas ir, sujungtos su nukleaze, pjauna DNR. ZFN reikalauja sudėtingesnio projektavimo, tačiau yra veiksmingos ir naudojamos ten, kur reikalingas aukštas tikslumas.

TALEN – panašūs į ZFN pagal veikimo principą, bet su kitokiu atpažinimo moduliu, kuris leidžia lengviau projektuoti sekų atpažinimą su mažesniais apribojimais nei ZFN.

Meganukleazės – natūralūs arba inžineriniai baltymai, atpažįstantys ilgas sekas (12–40 bp), todėl pasižymi dideliu specifinumu, bet jas modifikuoti, kad atpažintų naujas sekas, dažnai sudėtinga.

Pristatymo būdai

Norint redaguoti genomą, reikia efektyviai pristatyti redagavimo komponentus į ląstelę. Dažniausiai naudojami metodai:

• Virusiniai vektoriai (AAV, lentivirusai) – geri ekspresijai ir taikymui gyvuose organizmuose, bet riboti dydžiu ar kelia imuninį atsaką.
• RNP kompleksai (Cas baltymas + gRNA) – trumpalaikė ekspresija, mažesnis off‑target poveikis.
• Elektroporacija, mikroinjekcija – tiesioginis pristatymas izoliuotoms ląstelėms arba embrionams.
• Lipidų nanodalelės ir kiti nevirusiniai nešėjai – vystomi saugesniems in vivo pristatymo metodams.

Taikymai

Genomo redagavimas turi plačias panaudojimo galimybes:

• Moksliniams tyrimams – genų funkcijos išaiškinimui, ląstelių ir gyvūnų modelių kūrimui.
• Medicinoje (somatinė terapija) – gydymas paveldimų ligų (pvz., kai kurios hemoglobinopatijos), navikų imunoterapija (pvz., CAR‑T ląstelės), retinae ligų korekcijos. Daugelis somatinių genų redagavimo klinikinių tyrimų jau vyksta.
• Žemės ūkyje – atsparių ligoms arba streso sąlygoms augalų kūrimas, gyvulių veisimas.
• Biotechnologijoje – sintetinių biologinių dalių kūrimas, fermentų inžinerija ir kt.
• Ekologijoje – teorinės galimybės, pvz., genų „drive“ sistemoms, skirtoms invaziniams rūšims kontroliuoti (bet tai kelia didelių etinių ir ekologinių klausimų).

Norint suprasti geno ar baltymo funkciją, reikia įsikišti į jį tam tikra seka ir stebėti jo poveikį organizmui. Tačiau kai kuriuose organizmuose sunku arba neįmanoma atlikti specifinės vietos mutacijos. Todėl tenka taikyti netiesioginius metodus. Pavyzdžiai:

• Interesuojančio geno slopinimas trumposios RNR interferencijos (siRNA) metodu. Tačiau genų trikdymas naudojant siRNA gali būti nepastovus ir neišsamus.

• Genomo redagavimas naudojant nukleazes, pavyzdžiui, ZFN. Tai skiriasi nuo siRNA. Sukurta nukleazė (fermentas, kuris pjauna DNR) gali modifikuoti DNR prisijungimą. Todėl ji iš esmės gali nukirpti bet kurią tikslinę genomo vietą ir pakeisti genų, į kuriuos negalima konkrečiai nukreipti įprastinės RNRi, sekas.

Saugumas, ribotumai ir etika

Genomo redagavimas kelia svarbių saugumo ir etinių klausimų:

• Off‑target efektai: netikslūs pjūviai kituose genomo regionuose gali sukelti nenuspėjamus pakitimus. Siekiama sumažinti juos aukštos specifiškumo enzimų, trumpesnių gRNA arba papildomos analizės pagalba.
• Mozaiškumas ir heterogeniškumas: ypač ankstyvuose embrionų redagavimuose gali susidaryti mišrios ląstelių populiacijos, kai ne visos ląstelės koreguotos vienodai.
• Germinacinės ląstelės: genomo redagavimas, kuris pereina į palikuonius, kelia didesnę etinę ir reguliacinę riziką. Daugumoje šalių implantuoti modifikuotus embrionus į moters organizmą dar neleidžiama arba griežtai reguliuojama.
• Socialinės ir teisines pasekmės: prieinamumo, diskriminacijos, „designer baby“ diskusijos, biologinio saugumo klausimai.

Ateities kryptys

Tęsiami darbai, siekiant padidinti redagavimo efektyvumą ir saugumą: aukštesnės specifiškumo Cas variacijos, bazinis ir prime redagavimas, geresni pristatymo nešėjai, išplėstinė offtargetų analizė ir reguliacinės gairės. Klinikinių taikymų plėtra (ypač somatinėse terapijose) žada reikšmingų gydymo galimybių, tačiau germininės korekcijos ir embrionų modifikacijos išlieka ypač jautrios etikos ir teisės sritys.

"Nature Methods" 2011 m. Metų metodu išrinko genomo redagavimą. Šis metodas jau naudojamas, tačiau implantuoti modifikuotus embrionus į moters organizmą dar neleidžiama.

Klausimai ir atsakymai

K: Kas yra genomo redagavimas?

K: Kaip genomo redagavimo metu naudojamos dirbtinai sukurtos nukleazės?

K.: Kokie netiesioginių metodų, naudojamų genų funkcijai suprasti, pavyzdžiai?

K.: Kodėl genomo redagavimas buvo pasirinktas 2011 m. "Nature Methods" Metų metodu?

K.: Ar yra skirtingų tipų inžinerinių nukleazių, kurios gali būti naudojamos genomo redagavimui?

K: Kuo siRNA skiriasi nuo kitų metodų genų funkcijai suprasti?

K: Ar šiuo metu leidžiama implantuoti modifikuotus embrionus į moters organizmą?

Paieška pagal raidę