Dujų chromatografija-masės spektrometrija

Istorija

Pirmieji moksliniai darbai apie dujų ir skysčių chromatografiją buvo paskelbti 1950 m. Chemikai naudojo įvairius detektorius, kad pamatytų, jog iš chromatografo galo išteka junginiai. Dauguma detektorių junginius sunaikindavo, nes juos sudegindavo arba jonizuodavo. Dėl šių detektorių chemikai galėjo spėlioti, koks tiksliai yra kiekvieno mėginyje esančio junginio tapatumas. XX a. šeštajame dešimtmetyje Rolandas Gohlke ir Fredas McLafferty sukūrė naują kombinuotą aparatą. Jie dujų chromatografijoje kaip detektorių naudojo masės spektrometrą. Šie ankstyvieji prietaisai buvo dideli, trapūs ir iš pradžių buvo skirti tik laboratorijoms.

Dizainas buvo sudėtingas. Buvo sunku kontroliuoti laiko intervalą tarp skirtingų junginių išėjimo iš chromatografo. Todėl masės spektrometras turėjo baigti darbą su vienu junginiu prieš kitam junginiui ištekant iš chromatografo. Ankstyvuosiuose modeliuose masių spektrometro matavimai buvo įrašomi į grafinį popierių. Aukštos kvalifikacijos chemikai, norėdami identifikuoti kiekvieną junginį, išstudijuodavo smailių modelius. XX a. aštuntajame dešimtmetyje į masės spektrometrus buvo įtraukti analoginiai-skaitmeniniai keitikliai. Tai leido kompiuteriuose saugoti ir interpretuoti rezultatus. Kompiuteriai tapo greitesni ir mažesni, todėl GC-MS tapo greitesnė ir iš laboratorijų išplito į kasdienį gyvenimą. Šiandien kompiuterizuoti GC-MS prietaisai plačiai naudojami vandens, oro ir dirvožemio aplinkos stebėsenai. Jie taip pat naudojami reguliuojant žemės ūkį, maisto saugą ir atrandant bei gaminant vaistus.

Mažų kompiuterių kūrimas padėjo supaprastinti GC-MS aparatus. Be to, labai sutrumpėjo mėginio analizės laikas. "Electronic Associates, Inc. (EAI) buvo pirmaujanti JAV analoginių kompiuterių tiekėja. 1964 m. EAI pradėjo kurti kompiuteriu valdomą masės spektrometrą, kuriam vadovavo Robertas E. Finniganas. Iki 1966 m. buvo parduota daugiau kaip 500 dujų analizatorių prietaisų. 1967 m. buvo įkurta "Finnigan Instrument Corporation" (FIC). 1968 m. pradžioje Stenfordo ir Purdue universitetams pristatė pirmuosius keturpolinius GC-MS prietaisų prototipus. Galiausiai FIC buvo pervadinta į "Finnigan Corporation" ir tapo pasauline GC-MS sistemų lydere.

Pagrindinė operacija

GC-MS galima rasti visus mėginio objekte esančius mišrius junginius. Operatorius ištirpina mėginį skystyje. Tada operatorius skystį įpurškia į dujų srautą. (Dažniausiai naudojamos helio, vandenilio arba azoto dujos.) Dujos teka per vamzdelį su specialia danga. Kadangi kiekvienas mėginyje esantis junginys skirtingai prilimpa prie dangos, kiekvienas junginys išeina iš vamzdelio skirtingu laiku. Taigi danga naudojama atskirti kiekvieną junginį, kuris buvo susimaišęs mėginyje. Kai kiekvienas junginys išeina iš mėgintuvėlio galo, jis jonizuojamas ir įgyja elektros krūvį. Dauguma junginių suyra, kai yra jonizuojami. Skirtingi gabalėliai skrieja po magnetu, kuris atskiria gabalėlius pagal jų svorį ir krūvį. Tada kompiuteris išmatuoja visus kiekvieno junginio gabalėlius. Palygindamas matavimus su žinomų junginių kompiuterine biblioteka, kompiuteris sudaro visų mėginyje esančių junginių pavadinimų sąrašą. Kompiuteris taip pat gali nustatyti, kiek kiekvieno junginio buvo mėginyje.

Prietaisai

GC-MS sudaro du pagrindiniai blokai: dujų chromatografas ir masės spektrometras. Dujų chromatografas naudoja kapiliarinę kolonėlę, kuri priklauso nuo kolonėlės matmenų (ilgio, skersmens, plėvelės storio) ir fazės savybių (pvz., 5 % fenilpolisiloksano). Skirtingų mišinio molekulių cheminių savybių skirtumas atskiria molekules, kai mėginys keliauja kolonėlės ilgiu. Molekulėms reikia skirtingo laiko (vadinamo sulaikymo laiku), kad išeitų (išsisklaidytų) iš dujų chromatografo. Tai leidžia toliau esančiam masės spektrometrui atskirai fiksuoti, jonizuoti, pagreitinti, nukreipti ir aptikti jonizuotas molekules. Masių spektrometras tai atlieka suskaidydamas kiekvieną molekulę į jonizuotus fragmentus ir aptikdamas šiuos fragmentus pagal jų masės ir krūvio santykį.

Šie du aparatai, naudojami kartu, leidžia daug tiksliau identifikuoti medžiagas nei bet kuris iš jų atskirai. Vien dujų chromatografijos ar masių spektrometrijos metodais neįmanoma tiksliai identifikuoti konkrečios molekulės. Masių spektrometrijos procesui paprastai reikia labai gryno mėginio. Anksčiau dujų chromatografijoje buvo naudojami kiti detektoriai, pavyzdžiui, liepsnos jonizacijos detektorius. Šie detektoriai negali atskirti skirtingų molekulių, kurios per kolonėlę keliauja tiek pat laiko. (Kai dviejų skirtingų molekulių sulaikymo laikas yra vienodas, sakoma, kad jos "susilieja"). Kartu išsiskiriančios molekulės suklaidina kompiuterines programas, kurios nuskaito vieną abiejų molekulių masės spektrą.

Kartais dviejų skirtingų molekulių jonizuoti fragmentai masės spektrometre gali būti panašūs (masės spektras). Abiejų procesų derinimas sumažina klaidų tikimybę. Labai mažai tikėtina, kad dvi skirtingos molekulės elgsis vienodai ir dujų chromatografe, ir masės spektrometre. Todėl, jei masės spektras atitinka dominančią analitę, šio spektro sulaikymo laiką galima palyginti su charakteringu dujų chromatografo sulaikymo laiku ir taip padidinti įsitikinimą, kad analitė yra mėginyje.

Masės spektrometrų detektorių tipai

Dažniausiai su GC naudojamas keturpolis masės spektrometras. Hewlett-Packard (dabar Agilent) parduoda jį prekiniu pavadinimu "Masės selektyvusis detektorius" (MSD). Kitas gana paplitęs detektorius yra jonų gaudyklės masės spektrometras. Be to, galima rasti magnetinio sektoriaus masės spektrometrą. Tačiau šie prietaisai yra brangūs ir didelių gabaritų, todėl jų paprastai nerasite didelio našumo paslaugų laboratorijose. Naudojami ir kiti detektoriai, pavyzdžiui, skrydžio laiko (TOF), tandeminiai keturpoliai (MS-MS) (žr. toliau) arba jonų gaudyklės MS atveju ⁿ. N reiškia masės spektrometrijos pakopų skaičių.

Dujų chromatografo GC-MS vidus, dešinėje - dujų chromatografo kolona krosnelėje.


GC-MS schema

Analizė

Masių spektrometras paprastai naudojamas vienu iš dviejų būdų: Visiško skenavimo arba selektyvaus jonų stebėjimo (SIM). Įprastinis GC-MS gali veikti abiem būdais arba vienu metu.

Visiškas nuskaitymas MS

Renkant duomenis visiško nuskaitymo režimu, pasirenkamas tikslinis masės fragmentų intervalas ir įtraukiamas į prietaiso metodą. Tipiško plataus stebimo masės fragmentų diapazono pavyzdys yra nuo m/z 50 iki m/z 400. Nustatant, kokį intervalą naudoti, daugiausia atsižvelgiama į tai, ko tikimasi mėginyje, ir į tirpiklio bei kitų galimų trukdžių kiekį. Jei MS ieško labai mažos m/z masės fragmentų, jis gali aptikti orą ar kitus galimus trukdžius. Naudojant didelį nuskaitymo diapazoną, sumažėja prietaiso jautrumas. Prietaisas atliks mažiau nuskaitymų per sekundę, nes kiekvienas nuskaitymas užtruks ilgiau, kad būtų aptiktas platesnis masės fragmentų diapazonas.

Pilnas nuskaitymas naudingas nustatant nežinomus junginius mėginyje. Jis suteikia daugiau informacijos nei SIM, kai reikia patvirtinti ar nustatyti junginius mėginyje. Daugumą prietaisų valdo kompiuteris, kuris valdo kompiuterinę programą, vadinamą "prietaiso metodu". Prietaiso metodas valdo temperatūrą GC, MS skenavimo greitį ir nustatomų fragmentų dydžių diapazoną. Kai chemikas kuria prietaiso metodą, jis siunčia bandomuosius tirpalus per GS-MS visos skenavimo sistemos režimu. Taip patikrinamas GC sulaikymo laikas ir masės fragmento pirštų atspaudas prieš pereinant prie SIM prietaiso metodo. Specializuotiems GC-MS prietaisams, pavyzdžiui, sprogstamųjų medžiagų detektoriams, gamykloje iš anksto įkeliamas prietaiso metodas.

Pasirinktų jonų stebėjimas

Atrinktų jonų stebėsenos (SIM) metodu daugiausia dėmesio skiriama tam tikriems jonų fragmentams. Masių spektrometras aptinka tik tuos masės fragmentus. SIM metodo privalumai yra tai, kad aptikimo riba yra mažesnė, nes prietaisas kiekvieno skenavimo metu tiria tik nedidelį skaičių fragmentų (pvz., tris fragmentus). Kiekvieną sekundę galima atlikti daugiau nuskaitymų. Kadangi stebimi tik keli dominančios masės fragmentai, matricos trukdžiai paprastai yra mažesni. Kad padidėtų tikimybė teisingai nuskaityti teigiamą rezultatą, įvairių masės fragmentų jonų santykiai yra palyginami su žinomu etaloniniu standartu.

Jonizacijos tipai

Po to, kai molekulės įveikia visą kolonėlės ilgį, pereina per perdavimo liniją ir patenka į masės spektrometrą, jos įvairiais būdais jonizuojamos. Paprastai vienu metu naudojamas tik vienas jonizacijos metodas. Kai mėginys suskaidomas, jis aptinkamas, paprastai elektronų daugintuvo diodu. Diodas jonizuotą masės fragmentą traktuoja kaip elektrinį signalą, kuris vėliau aptinkamas.

Chemikai jonizavimo metodą pasirenka atskirai nuo pilno nuskaitymo arba SIM stebėjimo.

Elektronų jonizacija

Labiausiai paplitęs jonizacijos tipas yra elektroninė jonizacija (EI). Molekulės patenka į jonų gaudyklę (šaltinis yra kvadrupolis arba pati jonų gaudyklė jonų gaudyklėje), kur į jas patenka laisvieji elektronai, kuriuos išspinduliuoja siūlelis. Tai panašus siūlelis kaip standartinėje kaitinamojoje lemputėje. Elektronai pataiko į molekules, todėl molekulė suskyla būdingu būdu, kurį galima pakartoti. Taikant šį "kietosios jonizacijos" metodą, susidaro daugiau mažo masės ir krūvio santykio (m/z) fragmentų. EI metu susidaro nedaug fragmentų, kurių masė artima pradinės molekulės masei, jei iš viso susidaro. Chemikai kietuoju jonizavimu laiko elektronų šaudymą į mėginio molekules. Priešingai, "minkštoji jonizacija" - tai krūvio suteikimas mėginio molekulei, paveikus ją įvestomis dujomis. Molekulių fragmentacijos modelis priklauso nuo sistemai taikomos elektronų energijos, paprastai 70 eV (elektronvoltų). Naudojant 70 eV, galima palyginti iš tiriamojo mėginio gautus spektrus su žinomais bibliotekos spektrais. (Bibliotekos spektrai gali būti gauti iš gamintojo pateiktos programinės įrangos arba iš Nacionalinio standartų instituto (NIST-USA) sukurtos programinės įrangos). Programinė įranga atlieka paiešką bibliotekos spektruose naudodama atitikimo algoritmą, pavyzdžiui, tikimybe pagrįstą atitikimą arba taškinio sandaugos atitikimą. Daugelis metodų standartizavimo agentūrų dabar kontroliuoja šiuos algoritmus ir metodus, kad užtikrintų jų objektyvumą.

Cheminė jonizacija

Atliekant cheminę jonizaciją (CI), į masės spektrometrą įleidžiamos reagentinės dujos, paprastai metanas arba amoniakas. Skiriami du KI tipai: teigiamasis KI arba neigiamasis KI. Bet kuriuo atveju reagentinės dujos sąveikauja su elektronais ir analite ir sukelia "minkštą" dominančios molekulės jonizaciją. Minkštesnė jonizacija fragmentuoja molekulę mažiau nei kietoji EI jonizacija. Chemikai pirmenybę teikia CI, o ne EI. Taip yra todėl, kad CI sukuria bent vieną masės fragmentą, kurio masė yra beveik tokia pati kaip dominančios analitės molekulinė masė.

Teigiama cheminė jonizacija

Teigiamos cheminės jonizacijos (PCI) metu reagento dujos sąveikauja su tikslinėmis molekulėmis, dažniausiai su protonų mainų būdu. Taip susidaro santykinai dideli jonų rūšių kiekiai.

Neigiama cheminė jonizacija

Atliekant neigiamą cheminę jonizaciją (NCI) reagentinės dujos sumažina laisvųjų elektronų poveikį taikinio analitei. Dėl sumažėjusios energijos paprastai lieka didelis fragmentas. (Fragmentai toliau neskyla.)

Vertimas

Pagrindinis prietaisų analizės tikslas - išmatuoti medžiagos kiekį. Tai atliekama lyginant santykines atominių masių koncentracijas gautame masės spektre. Galimos dvi analizės rūšys: lyginamoji ir pradinė. Lyginamoji analizė iš esmės palygina duotą spektrą su spektrų biblioteka, siekdama išsiaiškinti, ar jo charakteristikos būdingos kokiam nors žinomam bibliotekoje esančiam mėginiui. Tai geriausia atlikti kompiuteriu, nes dėl mastelio pokyčių gali atsirasti daug vizualinių iškraipymų. Kompiuteriai taip pat gali koreliuoti daugiau duomenų (pavyzdžiui, sulaikymo laikus, nustatytus GC), kad tiksliau susietų tam tikrus duomenis.

Kitu analizės metodu smailės matuojamos viena kitos atžvilgiu. Taikant šį metodą aukščiausia viršūnė nustatoma 100 %. Kitoms smailėms suteikiama vertė, lygi smailės aukščio ir aukščiausios smailės aukščio santykiui. Priskiriamos visos vertės, viršijančios 3 %. Bendroji nežinomo junginio masė paprastai nurodoma pagal pagrindinę smailę. Šios tėvinės smailės vertė gali būti naudojama cheminei formulei su įvairiais elementais, kurie, kaip manoma, yra junginio sudėtyje, parinkti. Izotopų modelis spektre yra unikalus elementams, kurie turi daug izotopų. Taigi jis taip pat gali būti naudojamas įvairiems esantiems elementams identifikuoti. Tai pasako bendrą nežinomos molekulės cheminę formulę. Kadangi molekulės struktūra ir ryšiai skyla būdingais būdais, juos galima identifikuoti pagal smailės masių skirtumą. Identifikuotos molekulės struktūra turi atitikti GC-MS užfiksuotas charakteristikas. Paprastai šis identifikavimas atliekamas automatiškai kompiuterinėmis programomis, kurios tiekiamos kartu su prietaisu. Šios programos spektrus sulygina su žinomų junginių biblioteka, turinčia tą patį elementų, kurių gali būti mėginyje, sąrašą.

Atliekant "viso spektro" analizę atsižvelgiama į visus spektro "pikus". Tačiau selektyvioji jonų stebėsena (SIM) stebi tik pasirinktus pikus, susijusius su konkrečia medžiaga. Chemikai daro prielaidą, kad tam tikru sulaikymo laiku tam tikram junginiui būdingas jonų rinkinys. SIM yra greita ir veiksminga analizė. SIM geriausiai veikia tada, kai analitikas turi ankstesnę informaciją apie mėginį arba ieško tik kelių konkrečių medžiagų. Sumažėjus surinktos informacijos apie jonus tam tikroje dujų chromatografijos smailėje kiekiui, padidėja analizės jautrumas. Taigi SIM analizė leidžia aptikti ir išmatuoti mažesnį junginio kiekį. Tačiau sumažėja to junginio tapatybės tikrumo laipsnis.

GC-tandeminė MS

Kai pridedamas antrasis masės fragmentacijos etapas, pavyzdžiui, naudojant antrąjį kvadrupolį kvadrupoliniame instrumente, tai vadinama tandemine MS (MS/MS). MS/MS gerai tinka matuoti mažus tikslinių junginių kiekius mėginyje, kurio matricoje yra foninių junginių, kurie nedomina.

Pirmasis kvadrupolis (Q1) sujungtas su susidūrimo kamera (q2) ir kitu kvadrupoliu (Q3). Abu kvadrupoliai gali būti naudojami skenavimo arba statiniu režimu, priklausomai nuo naudojamos MS/MS analizės tipo. Analizės tipai: produkto jonų nuskaitymas, pirmtako jonų nuskaitymas, pasirinktų reakcijų stebėsena (SRM) ir neutralių nuostolių nuskaitymas. Pavyzdžiui: Kai Q1 veikia statiniu režimu (žiūrima tik į vieną masę, kaip SIM), o Q3 - skenavimo režimu, gaunamas vadinamasis produkto jonų spektras (dar vadinamas "dukteriniu spektru"). Iš šio spektro galima pasirinkti išsiskiriantį produktinį joną, kuris gali būti pasirinkto pirmtako jono produktinis jonas. Ši pora vadinama "perėjimu" ir sudaro SRM pagrindą. SRM yra labai specifiškas ir beveik visiškai pašalina matricos foną.

Programos

Aplinkos stebėsena ir valymas

Daugelis chemikų mano, kad GC-MS yra geriausia priemonė organiniams teršalams aplinkoje stebėti. GC-MS įrangos kaina labai sumažėjo. Kartu padidėjo GC-MS patikimumas. Abu patobulinimai padidino naudojimą aplinkosaugos tyrimuose. Kai kurių junginių, pavyzdžiui, tam tikrų pesticidų ir herbicidų, negalima nustatyti naudojant GS-MS. Jie pernelyg panašūs į kitus giminingus junginius. Tačiau atliekant daugumos aplinkos mėginių organinių medžiagų, įskaitant daugelį pagrindinių pesticidų klasių, analizę GC-MS yra labai jautri ir veiksminga.

Kriminalistinė ekspertizė

GC-MS gali analizuoti žmogaus kūno daleles ir padėti susieti nusikaltėlį su nusikaltimu. Teisės aktuose leidžiama naudoti GC-MS gaisro nuolaužoms analizuoti. Tiesą sakant, Amerikos bandomųjų medžiagų draugija (ASTM) yra parengusi gaisro liekanų analizės standartą. GCMS/MS šiuo atveju ypač naudinga, nes mėginiuose dažnai būna labai sudėtingų matricų, o teisme naudojami rezultatai turi būti labai tikslūs.

Teisėsauga

GC-MS naudojama neteisėtoms narkotinėms medžiagoms aptikti ir ilgainiui gali pakeisti narkotikus šnipinėjančius šunis. Ji taip pat dažnai naudojama teismo toksikologijoje. Ji padeda rasti narkotikų ir (arba) nuodų biologiniuose mėginiuose, paimtuose iš įtariamųjų, aukų ar mirusiojo kūno.

Apsauga

Po 2001 m. rugsėjo 11 d. teroristinių išpuolių sprogmenų aptikimo sistemos tapo visų JAV oro uostų dalimi. Šiose sistemose naudojamos įvairios technologijos, daugelis jų pagrįstos GC-MS. FAA yra sertifikuoti tik trys gamintojai, galintys tiekti šias sistemas. Pirmasis yra "Thermo Detection" (buvusi "Thermedics"), kuri gamina EGIS - GC-MS pagrįstą sprogmenų detektorių liniją. Antrasis - "Barringer Technologies", kuri dabar priklauso "Smith's Detection Systems". Trečioji - "Ion Track Instruments" (dalis "General Electric Infrastructure Security Systems").

Maisto produktų, gėrimų ir kvepalų analizė

Maisto produktuose ir gėrimuose yra daug aromatinių junginių, kai kurie iš jų natūraliai yra žaliavose, o kai kurie susidaro perdirbimo metu. Šių junginių, įskaitant esterius, riebalų rūgštis, alkoholius, aldehidus, terpenus ir t. t., analizei plačiai naudojama GC-MS. Ji taip pat naudojama aptikti ir įvertinti teršalus, kurie gali būti kenksmingi dėl gedimo ar falsifikavimo. Šiuos teršalus, pavyzdžiui, pesticidus, dažnai kontroliuoja vyriausybinės agentūros.

Astrochemija

Keletas GC-MS paliko Žemę. Du iš jų išvyko į Marsą pagal programą "Vikingas". Venera 11 ir 12 bei Pioneer Venus analizavo Veneros atmosferą naudodami GC-MS. Misijos "Cassini-Huygens" zondas "Huygens" vieną GC-MS nuskraidino į didžiausią Saturno mėnulį Titaną. Kometos 67P/Churyumov-Gerasimenko medžiagą 2014 m. chiraliniu GC-MS analizuos Rosetta misija.

Medicina

GC-MS naudojami atliekant naujagimių atrankinės patikros tyrimus. Šiais tyrimais galima nustatyti dešimtis įgimtų medžiagų apykaitos ligų (dar vadinamų įgimtomis medžiagų apykaitos klaidomis). GC-MS gali nustatyti junginius šlapime net ir labai mažais kiekiais. Šių junginių paprastai nebūna, tačiau jų atsiranda asmenims, sergantiems medžiagų apykaitos sutrikimais. Tai tampa įprastu IEM diagnozavimo būdu, leidžiančiu anksčiau nustatyti diagnozę ir pradėti gydymą. Tai galiausiai lemia geresnius rezultatus. Šiuo metu naujagimį galima ištirti dėl daugiau kaip 100 genetinių medžiagų apykaitos sutrikimų atliekant šlapimo tyrimą gimimo metu, remiantis GC-MS.

Kartu su medžiagų apykaitos junginių izotopiniu žymėjimu GC-MS naudojamas medžiagų apykaitos aktyvumui nustatyti. Dauguma taikymų grindžiami ¹³C žymėjimu ir ¹³C-¹² C santykio matavimu izotopų santykio masės spektrometru (IRMS). IRMS yra masės spektrometras su detektoriumi, skirtas matuoti kelis pasirinktus jonus ir grąžinti vertes kaip santykius.